流式细胞术检测和计数细菌之多种革兰氏阳性细

流式细胞术检测和计数细菌之多种革兰氏阳性细菌的表征分析
 
 微生物检测和计数已应用于多种研究领域，如环境监控等。流式细胞术为鉴定和计数不同基质中各种不同种属细菌提供了可能。通过合适的染色将背景区别开，以低上样次数并以极快的速度进行计数。现有测定法也可快速进行检测，但准确度较低（例如比浊法），或通过比较法以很慢的速度进行检测（CFU―菌落形成单位，通常情况下，通过培养并测定菌落数需要花费48 个小时），并可能需要进行连续稀释，以覆盖广泛的潜在浓度。相比之下，FCM（流式细胞术）能够在1 分钟以内即可得出结果。
 
 本文介绍了使用CytoFLEX流式细胞分析仪对多种革兰氏阳性细菌进行表征分析。在此有三点相关说明：第一，此文实验考察了多种革兰氏阳性细菌；第二，对八种有代表性的革兰氏阳性细菌样本和阴性对照样品进行了比较，涵盖了不同细菌种属包括球菌和杆菌，并测试了CytoFLEX 仪器对细菌检测和计数的能力；第三，显示了多种（6 种对数标度）浓度和流速范围内的计数线性
 
 革兰氏阳性细菌包含多种有经济意义的细菌属：通常因为其具有致病性，可导致食品污染（例如，单核细胞增多性李斯特氏菌等），或与疾病和感染有关（例如，葡萄球菌和链球菌等）。
 流式细胞术检测和计数细菌之多种革兰氏阳性细菌的表征分析
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 标准流程
 在进行CytoFLEX 分析前需要进行样本前处理，将每种待检测的细菌培养基用PBS 重悬并利用比浊法（光密度法）检测细菌浓度，将浓度调整至0.5McFarland 单位（麦氏浊度单位），或150 x 106mL-1 的菌浓度，将这个浓度标记为[1x]。取出两份样品，使用PBS 进一步稀释10 倍和100 倍，分别为15 或 1.5 x 103 μL-1 的菌浓度。
 
 对未染色样本和利用核酸染料SYTO（一种具有核酸着染性的活体染料混合物）进行标记的样本进行流式检测（SYTO BC 试剂盒由Thermo Fischer Scientific 公司提供）。根据生产商提供的使用说明来使用染料：1 mL 样品用1 μL 储存原液（溶于DMSO）进行染色，但实验中发现这种染色方案会导致明显的二次着染。通过以1：1000 比例稀释储备原液（将1 μL 原始储备液加入1 mL PBS）得到二级储备液，然后以1：100 的稀释比例作为工作浓度进行染色（5 μL/500 μL 小份样品，或1% 的建议浓度），就能得出很好的染色效果
 
 仪器配置
 本实验仅需要利用蓝色激光来进行前向和侧向散射光的分析（FSC 和SSC）， 并利用FITC 通道测定绿色SYTO 荧光，所以本试验可使用任何配置的CytoFLEX 进行分析。
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 数据获取设置
 一般情况下，细菌比大多数真核细胞要小，因此，在利用流式分析细菌时我们需要对CytoFLEX 默认的FSC （前向散射）和SSC（侧向散射）信号增益进行设置。荧光通道增益设置在正常范围内。
 通过在固定检测流速内进行固定时间的数据获取，可以得到固定的检测体积，并更简单明了地减去任何背景计数。
 比如，进行初步表征分析时，以10 μL/ 分钟（低）流速，时间为30 秒，因此，固定的体积为5 μL/ 样品。
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 以下一系列流式图均显示未设门密度图并用两个散射光的对数表示，并用一个通用的门对细菌进行圈门（品红色）。除了对照外，本分析图均显示了未染色样品图。
 第二个流式图是将SYTO 阳性群进行设门的散射光对数图，但这个散点图利用一个蓝色的门对细菌进行圈门。根据SYTO 阳性群，将第二个区域定义为“活的”（蓝色）。
 最后一个散点图是绿色（SYTO）荧光通道FITC 的单一参数叠加直方图，可比较未标记的和标记的细菌样品比例差别，并将“SYTO+”区域用于对第二个图进行设门。
 
 注：
 即使在SYTO 染料浓度较低（低至建议浓度的1%）的情况下进行检测，如果在检测了染色样品后紧接着检测未染色的（阴性对照）样品，我们需要对管路进行冲洗，防止污染。我们可以在样品数据获取过程中使用SYTO 荧光对时间的散点图来进行监测。据推测，产生这种情况的原因是染料吸附在进样管内，然后在后续的上样过程中染料被释放出来而造成污染。可按样品上样方式运行一份小体积次氯酸钠稀释液（10%），并使用蒸馏水进行冲洗，可有效控制这个问题。
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 时间进程QC 显示SYTO- 标记的阳性样本（上图），显示由于染料吸附在管路上和释放导致的剧烈时程标记的阴性对照，以及样品管线清洁后的正确阴性对照（下图）。
 
 本应用说明中显示的结果仅代表在贝克曼库尔特 CytoFLEX 流式细胞仪上产生的结果。由于分析仪之间存在性能差异，因此，作者不能保证使用其他的流式细胞仪可得出相似的结果。
 
 试剂详情
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 * CytoFLEX 流式细胞仪仅用于科学研究，不用于临床诊断。